PicoPLEX技術(shù)助力輔助生殖研究

更新時(shí)間：2020-10-10 點(diǎn)擊次數(shù)：1827

輔助生殖技術(shù)（包括人類輔助生殖技術(shù)和人類精子庫(kù)）是指運(yùn)用醫(yī)學(xué)技術(shù)和方法對(duì)配子、合子、胚胎進(jìn)行人工操作，以達(dá)到受孕目的的技術(shù)，分為人工授精技術(shù)、體外受精－胚胎移植技術(shù)及相關(guān)衍生技術(shù)^【1】。

其中體外受精-胚胎移植技術(shù)及其各種衍生技術(shù)（In vitro fertilization, IVF）近些年來(lái)備受關(guān)注。簡(jiǎn)單的說(shuō)，就是大家耳熟能詳?shù)?span style="color:rgb(255, 0, 0); font-family:& font-size:11pt">試管嬰兒技術(shù)。

“試管嬰兒”的前世今生？

1978年世界上*試管嬰兒誕生，從此開創(chuàng)了生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新紀(jì)元。

試管嬰兒是指從女性體內(nèi)取出卵子，在器皿內(nèi)培養(yǎng)后，加入經(jīng)技術(shù)處理的精子，待卵子受精后，繼續(xù)培養(yǎng)，到形成早早期胚胎時(shí)，再轉(zhuǎn)移到子宮內(nèi)著床，發(fā)育成胎兒直至分娩的技術(shù)^【1】。

試管嬰兒技術(shù)的分類

第三代試管嬰兒的分類

為什么選擇PGT-A？

雖然試管嬰兒技術(shù)給不能孕育的夫婦帶來(lái)了希望，但胚胎染色體數(shù)目異常在常規(guī)體外受精中較常發(fā)生，且高齡女性胚胎染色體異常的發(fā)生率更高。
PGT-A技術(shù)，對(duì)植入前的胚胎細(xì)胞進(jìn)行染色體非整倍體以及染色體拷貝數(shù)變異檢測(cè)，選擇染色體數(shù)目正常的胚胎，可有效提高體外受精的成功率，有助于輔助生殖技術(shù)的推廣應(yīng)用。

PGT-A的研究方法

前幾年主要通過(guò)熒光原位雜交（FISH）技術(shù)、比較基因組雜交芯片（aCGH）技術(shù)進(jìn)行PGT-A分析。隨著二代測(cè)序（NGS）的快速發(fā)展，人們將目光轉(zhuǎn)向NGS方法，以期進(jìn)行更正確的評(píng)估。

PGT-A研究的難點(diǎn)之一是選擇合適的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)

基于NGS技術(shù)進(jìn)行PGT-A研究時(shí)，由于每個(gè)胚胎細(xì)胞中的DNA非常少（皮克級(jí)），遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到測(cè)序所需的樣品量，因此需要先對(duì)單細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification, WGA），而這一過(guò)程必須盡可能避免樣本的損失和污染，并盡可能保證擴(kuò)增的覆蓋度、均一性等，這都是極其困難的，所以選對(duì)單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)很重要！

Takara致力于為科學(xué)研究提供支持，傾力推出的PicoPLEX技術(shù)，目前廣泛用于PGT-A研究。接下來(lái)讓我們一起來(lái)看一下：

PicoPLEX技術(shù)是如何正確而高效的進(jìn)行PGT-A研究

■ 操作簡(jiǎn)便，避免珍貴樣品的損失

整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程是 “飛一般的感覺(jué)”（見(jiàn)下圖），就三小時(shí)，就三小時(shí)（細(xì)胞裂解→預(yù)擴(kuò)增→低背景的PCR擴(kuò)增），便可獲得微克級(jí)的DNA產(chǎn)物。過(guò)程中不需要轉(zhuǎn)管和純化，減少過(guò)多實(shí)驗(yàn)操作可能帶來(lái)的樣本損失！

■ 炫酷的“準(zhǔn)線性預(yù)擴(kuò)增+發(fā)夾結(jié)構(gòu)”加持，保證擴(kuò)增的均一性

在經(jīng)過(guò)細(xì)胞裂解后，以DNA作為模板使用準(zhǔn)線性擴(kuò)增方法進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，并在每個(gè)循環(huán)后形成一個(gè)不能被進(jìn)一步擴(kuò)增的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣做的好處是有效避免PCR過(guò)程中可能引入的擴(kuò)增錯(cuò)誤無(wú)限放大，避免序列偏向性。

■ 可用于高品質(zhì)的染色體變異（CNV）分析

利用單卵裂球活體組織檢查樣品進(jìn)行PicoPLEX WGA Kit擴(kuò)増標(biāo)記后，與24 sure array雜交，結(jié)果清晰地顯示了CNV（上圖）。2011年ESHRE（歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)）的臨床實(shí)驗(yàn)證明了采用PicoPLEX 技術(shù)進(jìn)行人類染色體核型分析的準(zhǔn)確性。

■ 實(shí)例大公開：進(jìn)行PGT研究時(shí)，PicoPLEX性能出色

來(lái)自西班牙Sistemas Genómicos Ltd.的Vendrell^【2】的團(tuán)隊(duì)，開發(fā)了一種高度可靠的檢測(cè)單個(gè)卵裂球和5-10滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞樣品的染色體異倍性的實(shí)驗(yàn)方法。其中使用PicoPLEX試劑盒擴(kuò)增獲得gDNA產(chǎn)物用于后續(xù)NGS分析。實(shí)驗(yàn)表明，未擴(kuò)增的對(duì)照DNA樣品和來(lái)自單個(gè)卵裂球的WGA產(chǎn)物在測(cè)序數(shù)據(jù)上基本沒(méi)有差異，且可以正確地檢測(cè)染色體異倍性。

表明使用PicoPLEX技術(shù)具有高再現(xiàn)性，適用于PGT-A分析。

拓展：無(wú)創(chuàng)胚胎植入前非整倍體基因檢測(cè)（niPGT-A）

盡管胚胎活檢被認(rèn)為是一種相對(duì)安全的方法，但其他侵入性較小的技術(shù)近也受到關(guān)注。研究表明，可以通過(guò)檢測(cè)釋放到培養(yǎng)基中的游離DNA（cfDNA），即無(wú)創(chuàng)胚胎植入前非整倍體基因檢測(cè)（niPGT-A）來(lái)判斷胚胎非整倍體情況。由于cfDNA的含量遠(yuǎn)少于侵入式活檢的細(xì)胞DNA，因此具有高靈敏度和低偏差的WGA方法對(duì)于niPGT-A獲得足夠的材料進(jìn)行下游分析至關(guān)重要。

來(lái)自南加州大學(xué)的Jacqueline團(tuán)隊(duì)^【3】，通過(guò)對(duì)廢胚胎培養(yǎng)基（SEM）中提取的cfDNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，分析胚胎染色體的非整倍性，驗(yàn)證無(wú)創(chuàng)胚胎植入前基因檢測(cè)非整倍體檢測(cè)（niPGT-A）的可靠性。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)SEM，滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞和完整胚胎樣本使用PicoPLEX進(jìn)行WGA，然后利用NGS方法進(jìn)行PGT-A分析。結(jié)果表明，使用63.2 ng/ul的cfDNA足以用于正確的進(jìn)行染色體異倍性分析，但一致性略低。這也表明，PicoPLEX技術(shù)可以提供高質(zhì)量的基因組DNA, 助力niPGT-A分析。

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