ProteanFect Max (PT02) 轉(zhuǎn)染人源CD34⁺造血干細胞操作攻略

CD34+造血干細胞的分選

對于人源CD34+造血干細胞，合適的培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)染時間對細胞的成功轉(zhuǎn)染非常關(guān)鍵。CD34+造血干細胞分選后需要培養(yǎng)一段時間恢復細胞狀態(tài)后，以實現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)染效率。以來自動員人單采血或臍帶血開始，可以使用市面上陽性選擇分選試劑盒分離得到CD34+細胞群。本實驗所用細胞為動員人單采血，分離試劑為Lymphoprep™（Stemcell，07861），分選試劑盒為CD34 MicroBead Kit, human（Miltenyi Biotec, 130-046-702）。具體實驗操作參考其官·方說明書。

注：在紅細胞數(shù)量較多的情況下，應先分離PBMC，再使用試劑盒進行分選。具體操作應根據(jù)所選材料和試劑盒說明書進行細胞分選。

CD34+造血干細胞完·全培養(yǎng)基的配制

SFEM II培養(yǎng)基（Stemcell，09655）和StemSpan™ CC100（Stemcell，02690）以99：1比例充分混合后使用（若添加抗生素則抗生素稀釋1000倍），配置完培養(yǎng)基放置于4℃冰箱儲存（盡量在1個月內(nèi)使用完）。

CD34+造血干細胞的培養(yǎng)與傳代

1.分選得到的CD34+造血干細胞300 g離心5 min，用1 mL完·全培養(yǎng)基重懸后，取樣計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果用完·全培養(yǎng)基重懸到105 cells/mL活細胞密度，接種到T25培養(yǎng)瓶或細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。

2.3天后補液一次，調(diào)整細胞密度至2×10⁵ cells/mL，之后隔天補液調(diào)整密度至2×10⁵ cells/mL ，培養(yǎng)時細胞密度控制在1.5×10⁶cells/mL 以內(nèi)。

注：若不及時補液，細胞狀態(tài)及后續(xù)擴增受不可逆影響。

3.推薦在CD34⁺造血干細胞分離后培養(yǎng)5-10天進行轉(zhuǎn)染。如果細胞分離后直接轉(zhuǎn)染或細胞傳代時間過長后再轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的細胞活力與轉(zhuǎn)染效率可能會降低或者CD34⁺造血干細胞比例偏低。對于使用上述動員單采血來源的CD34⁺造血干細胞，最佳的轉(zhuǎn)染時間點是在分離培養(yǎng)后的第5天。    

使用ProteanFect Max（PT02)進行人CD34+造血干細胞轉(zhuǎn)染

1.轉(zhuǎn)染的核酸：mRNA

2.適合轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基：使用Opti-MEM培養(yǎng)基（或無血清RPMI 1640/無血清DMEM培養(yǎng)基）進行轉(zhuǎn)染。

3.配置ProteanFect Max轉(zhuǎn)染體系：具體詳見表1-3。轉(zhuǎn)染體系在配置過程中出現(xiàn)粘稠現(xiàn)象屬于正常。

4.轉(zhuǎn)染前細胞準備：確保細胞處于良好生長狀態(tài)，活率需超過90%。調(diào)整細胞轉(zhuǎn)染密度時，避免反復離心，以免延長處理時間，影響細胞活力和轉(zhuǎn)染效率。    

5.細胞轉(zhuǎn)染：孵育時間建議保持在15分鐘，適當延長時間可提高轉(zhuǎn)染率，但可能影響細胞活力。

6.轉(zhuǎn)染效率與細胞活率檢測：使用陽性對照mRNA時，可在轉(zhuǎn)染后5-48小時內(nèi)觀察EGFP的表達。細胞活率可通過鏡下觀察、臺盼藍、AO/PI染色或流式細胞術(shù)等方法檢測，若細胞狀態(tài)良好，鏡下觀察可見細胞圓潤透亮。

表1. ProteanFectMax轉(zhuǎn)染人源CD34⁺造血干細胞實驗操作步驟說明

（以96孔板轉(zhuǎn)染mRNA為例）

a. 由于人源CD34+造血干細胞的個體差異較大建議先加入13.5 μL的Reagent C。如果細胞活率不佳，可將Reagent C的使用量下調(diào)至8 μL。

表2. ProteanFect Max轉(zhuǎn)染不同類型核酸的實驗操作步驟說明（以96孔板轉(zhuǎn)染為例）

a. 建議mRNA濃度≥1 μg/mL。如需同時轉(zhuǎn)染多個mRNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個mRNA時保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的mRNA總量為0.5 µg。

b. 建議siRNA濃度≥20 μM。如需同時轉(zhuǎn)染多個siRNA，為確保在轉(zhuǎn)染多個siRNA時保持高效的轉(zhuǎn)染效果，加入的siRNA總量為40 pmol。

    表3. ProteanFect Max轉(zhuǎn)染不同細胞培養(yǎng)孔板規(guī)格的各組分使用量

a. 由于CD34+造血干細胞存在較大個體差異，建議對Reagent C進行多個梯度測試，以綜合考慮細胞活率和轉(zhuǎn)染效率，從而選擇最佳方案。Reagent C的使用量可低下調(diào)至初始量的50%。

細胞活率和表達效率分析

在轉(zhuǎn)染 EGFP mRNA后，可通過臺盼藍染色和流式細胞術(shù)對CD34+造血干細胞轉(zhuǎn)染后的細胞活力與轉(zhuǎn)染效率進行分析。首先通過熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染后細胞的EGFP蛋白質(zhì)表達、細胞形態(tài)和活力進行定性評估（圖 1）。同時，收集轉(zhuǎn)染后的細胞進行臺盼藍染色檢測活細胞密度，流式染色PE anti-human CD34 Antibody（Biolegend ,343506）以定量分析CD34+造血干細胞的轉(zhuǎn)染效率。細胞收集完成后，離心棄去培養(yǎng)基，用1 × DPBS重懸細胞，加入PE anti-human CD34 Antibody，4℃避光染色15分鐘后洗滌去上清，用1 × DPBS重懸細胞，進行流式檢測（圖2）。

圖1. 利用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染EGFP mRNA在人源CD34+造血干細胞中的表達。熒光圖（左）和明場圖（右）顯示，ProteanFect Max轉(zhuǎn)染人源CD34+造血干細胞中1天后。絕大部分細胞表達綠色熒光蛋白，說明ProteanFect Max在人源CD34+造血干細胞中中具有較高的轉(zhuǎn)染效率。

圖2. 利用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染EGFP mRNA在人源CD34⁺造血干細胞中表達的流式分析圖。使用ProteanFect Max轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染EGFP mRNA，在轉(zhuǎn)染后24小時檢測到約有61.9%細胞表達EGFP蛋白。

常見問題

1. 如何提升轉(zhuǎn)染效率

1）延長轉(zhuǎn)染時間：根據(jù)細胞狀態(tài)適當延長轉(zhuǎn)染時間，通常不超過30分鐘。

2. 關(guān)于試劑盒中陽性對照的使用建議

首·次嘗試時，建議設置陽性對照組（EGFP mRNA），以檢測實驗操作和試劑的有效性。使用96孔板的細胞量即可，節(jié)省細胞和試劑。

2. 轉(zhuǎn)染時的細胞數(shù)范圍

說明書中提供了最佳轉(zhuǎn)染條件下的細胞數(shù)量范圍，但在特殊情況下，即使細胞數(shù)量較少，也可以進行轉(zhuǎn)染。以96孔板為例，建議細胞數(shù)量不低于2×105/孔，以確保后續(xù)檢測的可靠性。

3. 轉(zhuǎn)染后細胞狀態(tài)與活力

轉(zhuǎn)染后，細胞狀態(tài)可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進行轉(zhuǎn)染時，對細胞活力的損傷較小。通常在轉(zhuǎn)染3天后，細胞狀態(tài)會基本恢復。

4. 轉(zhuǎn)染后細胞離心后看不到沉淀

對于小體積轉(zhuǎn)染體系（如96孔板），離心后細胞沉淀不明顯是正?，F(xiàn)象。細胞沉淀可能散落在離心管側(cè)壁，不影響后續(xù)結(jié)果。為減少細胞損失，離心后移液時應避免槍頭緊貼底部。